外泌體純化方法比較
SEC、TFF、UC該如何選擇？

外泌體純化是影響下游分析成敗的關鍵，傳統方法難以同時兼顧「高回收率」與「高純度」。為解決此痛點，目前學界與業界推薦的核心解決方案為「TFF 濃縮 + SEC 純化」組合：

• TFF (切向流過濾)： 快速濃縮大體積樣品，達高回收率。

• SEC (粒徑篩析)： 溫和分離雜質，保留外泌體活性與結構完整性。 此為兼顧純度與產率的最佳解方。

內容大綱

為什麼要分離純化外泌體？

外泌體 (exosomes) 或其它細胞外囊泡 (Extracellular Vesicles, EVs) 的分離、純化與濃縮（富集）是決定下游分析 (downstream analysis)、生物功能研究、臨床應用可靠性的關鍵步驟。純化品質將直接影響後續的 RNA / protein analysis、細胞功能試驗、生物標記分析，甚至臨床應用結果。

若純度不足，常見的干擾物，如蛋白質、脂蛋白 (lipoproteins) 或細胞碎片，可能導致判讀錯誤、功能性偏差，甚至造成研究結果無法重現。因此，「如何高效分離純淨的外泌體」已成為突破學術研究與臨床應用瓶頸的首要課題。

延伸閱讀： 胞外囊泡 (EVs) 研究流程：新手入門指南

外泌體純化的核心挑戰

外泌體純化最大的困難，在於 EVs 的粒徑極小、具異質性(heterogeneity)，且與蛋白聚集體、脂蛋白 (lipoproteins) 等雜質尺寸接近，因此難以完全分離。

因此，高回收率 (Recovery) 並不等於 高純度 (Purity)，錯誤的純化方法可能導致：EVs 結構受損、蛋白污染偏高、下游應用數據偏差。。

哪種萃取方法最適合外泌體分離？

外泌體分離方法依照原理的不同，常見方法可分為以下幾種：

1. 超速離心法 (Ultracentrifugation, UC)
   

   利用高速旋轉的離心力差異進行分層分離。UC曾長期被視為EVs分離的傳統「黃金標準 (gold standard)」且處理量大，但操作極為耗時，且高強度的離心力容易破壞外泌體的結構完整性。

2. 粒徑篩析層析法 (Size Exclusion Chromatography, SEC)
   

   又稱凝膠過濾層析法 (gel filtration)，是利用多孔樹脂讓大顆粒外泌體先流出、小分子雜質後流出的特性進行分離。其最大優點是能保持外泌體的生物活性與結構，且純度表現優異，目前被認為是最能兼顧 EVs 結構完整性與純度的主流方法之一。

3. 超過濾法 (Ultrafiltration, UF)
   

   利用特定濾膜孔徑截留EVs並篩除雜質。UF操作快速、成本較低、且不需昂貴設備，常用於EVs前處理及濃縮步驟，特別適合小體積樣品。但傳統過濾 (dead-end filtration) 容易堵塞濾膜、造成EVs損耗，因此近年逐漸由切向流過濾 (TFF) 取代。

4. 切向流過濾法 (Tangential Flow Filtration, TFF)
   

   TFF屬於超濾技術 (UF) 的一種形式，其也是利用特定濾膜孔徑截留EVs，但TFF的樣品沿濾膜表面平行流動，可降低濾膜堵塞與剪切壓力。相較傳統超過濾 (UF)，TFF 特別適合大體積樣品處理、高回收率 (recovery) 與製程放大 (scale-up)，因此近年已成為EVs大量純化的重要技術。
   
   延伸閱讀：外泌體萃取技術－如何使用切向流過濾純化外泌體？

5. 沉澱法 (Precipitation)
   

   加入聚合物（如 PEG）降低外泌體溶解度使其析出。操作最為簡單且回收率高，適合快速篩選，但純度較低，容易同時沉澱出大量非目標蛋白雜質。

6. 免疫親和法 (Immunoaffinity, IA)
   

   利用特異性抗體精準捕獲外泌體表面的標記蛋白。這能獲得最高純度與特異性的樣本，甚至能分離出特定來源的外泌體，但成本昂貴且不適合大規模處理。

7. 離子交換層析 (Ion Exchange Chromatography)
   

   依分子表面電荷差異而進行分離的技術。採用帶正電的濾膜捕捉帶負電的EVs，建議搭配TFF或SEC使用，從複雜樣品中進一步提高純度。

綜合以上優勢，目前許多應用採用「TFF 濃縮 + SEC 純化」的組合策略，因此逐漸成為兼顧高回收率及高純度的主流策略，也被稱為「新黃金標準」。

▍  EVs 純化新黃金標準 = TFF 濃縮 + SEC 純化

此外，不同研究目的對 EVs 的要求也不同，因此應依目的選用最適合的純化方法。

• RNA sequencing：重視純度 (purity)
• Functional assay：重視活性及完整性 (integrity)
• Biomarker analysis：重視再現性 (reproducibility)
• 大量製備：重視擴展性 (scalability)

如何選擇適合的外泌體純化方法？

HansaBioMed Life Sciences提供多種 EVs 分離、純化與 表徵 (characterization) 工具，可依不同研究需求建立完整 EVs workflow。

EVs萃取後的品質驗收

在完成exosomes及EVs的分離與純化後，進入正式實驗或臨床應用前，必須進行嚴謹的「驗收」流程。這不僅是為了驗證純化技術的效率，更是為了確保後續生物功能分析的數據具有科學公信力與可重複性。根據國際細胞外囊泡學會（ISEV）的建議，定量及表徵 (EVs Characterization) 應涵蓋以下三個維度：

1. 物理與定量驗證
   

   透過 NTA（奈米徑跡分析）或電鏡分析確認粒徑分佈、濃度，用以確保樣本符合典型外泌體粒徑分布並排除雜質干擾。

2. 生物標記鑑定

   藉由檢測 CD9、CD63、CD81 等特異性蛋白標記，或跨膜蛋白、胞質或細胞膜來源蛋白，驗證樣本具有 EVs 相關特徵。。

3. 非 EV 共分離成份 (non-EV proteins)
   

   用以評估樣品純度並區分非 EV 來源的污染物，常見 non-EV markers 包括 albumin、ApoA1、GM130 等。
   
   延伸閱讀：
   胞外囊泡 (EVs) 研究流程：新手入門指南-EVs 研究流程
   從探索到驗證：為何需要「外泌體標準品」，而不是塑膠微珠？

▍ 不知道該選 SEC、TFF還是UC嗎？

不同 EVs 樣品及研究目的，需要不同的純化策略。

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外泌體的應用

• 精準診斷：
  作為生物標記，協助癌症與神經退化性疾病（如阿茲海默症）的早期篩查與病程預後。

• 臨床治療：
  應用於再生醫學（如組織修復、血管新生）與藥物傳遞，將治療劑精準送達目標病灶。

• 機制研究：
  透過分析其內載核酸，深入解析疾病的發生機制與細胞間的訊息交流。

參考文獻

• 胞外囊泡 (EVs) 研究流程：新手入門指南
• 外泌體分離, Rocker Scientific Co., Ltd.
• 切向流過濾, Rocker Scientific Co., Ltd.
• A Review of Exosomal Isolation Methods: Is Size Exclusion Chromatography the Best Option, Sidhom et al., International Journal of Molecular Science, 2020
• Exosome: A Review of Its Classification, Isolation Techniques, Storage, Diagnostic and Targeted Therapy Applications, Zhang et al., International Journal of Nanomedicine, 2020
• Isolation of extracellular vesicles with combined enrichment methods, Stam et al., Journal of Chromatography B, 2021
• Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018)-a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines, Journal of Extracellular Vesicles, 2018
• Review on Strategies and Technologies for Exosome Isolation and Purification, Chen et al., Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2022

常見問題 (FAQ)

Q1: 為什麼在進行外泌體研究或臨床應用前，必須先進行分離與純化？

A1: 這是因為原始的生物樣本（如血清、細胞培養液）極其複雜，含有大量物理性質相似的干擾物（如細胞碎片、脂蛋白、蛋白聚集體）。若不進行精準的分離與純化，這些雜質會干擾下游的生物功能評估，導致實驗結果不準確。因此，「高效分離純淨的外泌體」是確保臨床應用與學術研究成敗的關鍵。

Q2: 目前學術界最常使用的外泌體分離「黃金標準」是什麼方法？有什麼優缺點？

A2: 超速離心法（UC） 曾長期被視為 EVs 分離的傳統標準方法。

• 優點： 技術成熟、適合處理大體積樣本。
• 缺點： 操作極度耗時（通常超過 4 小時）、勞動強度高，且強大的離心力可能導致外泌體變性、失活或結構受損。

因此，目前漸被其它方法取代，而 「TFF + SEC」 則作為目前主流的純化策略。

Q3: 若想保持外泌體的「生物活性」與「結構完整」，建議選擇哪種分離方法？

A3: 建議選擇 粒徑篩析層析法（SEC）。此方法利用多孔樹脂讓外泌體與小分子雜質依尺寸流出，最大的優點是分離過程溫和，確保外泌體的功能與形態完整，且具有極高的再現性，且SEC 對於蛋白污染去除效果通常優於 UC。

針對大體積樣品樣品，建議採用「TFF 濃縮 + SEC 純化」的組合策略，兼顧高回收率及高純度。
- TFF：用於初步分離及大體積濃縮
- SEC：用於進一步純化

Q4: 如何降低外泌體的蛋白污染？

A4: 降低蛋白污染的關鍵，在於避免高蛋白雜質（如 albumin、lipoproteins）與 EVs 共分離。目前常見策略包括：

• 搭配 TFF 進行前段濃縮與 buffer exchange
• 使用 SEC 去除游離蛋白
• 避免單一使用沉澱法（Precipitation）
• 增加清洗步驟 (washing)
• 使用離子交換層析膜進一步提升純度

其中，「TFF 濃縮 + SEC 純化」是目前最常見的高純度主流方法。

Q5: 如何進行大量外泌體純化？

A5: 若需處理大量樣品（如細胞培養液、臨床樣本），目前主流方法為切向流過濾（TFF）。

相較傳統超高速離心（UC），TFF 具備：高回收率、低EVs損傷、操作快速、可放大生產 (scale-up) 等優點。因此，TFF 已逐漸成為大量 EVs 純化與未來產業化的重要技術。

Q6: 如何選擇最適合的分離方法？

A6: 應根據研究目標及成本進行權衡：

• 追求最高純度與特異性： 選擇 免疫親和法（IA），能利用抗體捕獲特定亞群的外泌體，但成本較高。
• 追求快速篩選與高回收率： 選擇 沉澱法（Precipitation），操作最簡單，但純度較低。
• 追求快速濃縮且不需昂貴設備： 選擇 超過濾法（UF），但需注意濾膜堵塞導致的樣本損耗。
  

更詳細的選擇請參考：如何選擇適合的外泌體純化方法？