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【微生物檢測】水中總菌落數檢測方法-濾膜法
一、方法概要
本方法係使用濾膜過濾水樣,於 35 ± 1℃ 以 m-HPC 培養基培養48 ± 3 小時後,計數水中好氧及兼性厭氧異營菌。
二、適用範圍
本方法適用於飲用水及地面水體、地下水體、廢水、污水、放流水之總菌落數檢測。
三、干擾
(一) 水樣中含有抑制或促進細菌生長的物質。
(二) 檢測使用的玻璃器皿及設備含有抑制或促進細菌生長物質。
(三) 濁度過高之水樣易造成濾膜孔隙阻塞,或造成細菌菌落瀰漫生長(Spreading)而影響水樣檢驗的觀察及結果的判讀。
四、設備
(一) 試劑水:導電度在 25℃ 時小於 2 μmho/cm(μS/cm)。
(二) 培養基 m-HPC 瓊脂培養基(或稱 m-SPC 瓊脂培養基),依下列配方配製培養基,或使用市售商品化的培養基均可。
將甘油以外之成份混合,以 1 N 之氫氧化鈉溶液調整 pH 值至 7.1 ± 0.2,加熱溶解後加入甘油,121℃ 高溫高壓滅菌 5 分鐘。待冷卻至約 50℃ 時,於無菌操作檯內分裝至無菌培養皿中,使培養基厚度約 2 至 4 mm。室溫下靜置凝固後,保存於 4 ± 2℃,保存期限為 14 天。可根據檢測需求量,依配方比例配製培養基。
(三) 無菌稀釋液
六、採樣與保存
(一) 採微生物檢測之水樣時,應使用清潔並經滅菌之玻璃瓶、無菌塑膠容器或市售無菌採樣袋,且於採樣時應避免受到污染。水樣若含有餘氯時,應使用內含硫代硫酸鈉錠劑之無菌採樣袋,或於無菌容器中加入適量無菌之硫代硫酸鈉以中和餘氯(採取加氯之廢水時,每100 mL 之水樣如加入 0.1 mL 之 10% 硫代硫酸鈉,可中和之餘氯量約為 15 mg/L。採取含氯之飲用水水樣時,每 100 mL 之水樣如加入 0.1 mL 之 3% 硫代硫酸鈉,可中和之餘氯量約為 5 mg/L)。
(二) 飲用水採樣前應清潔手部,出水口以火烤或以 70% 至 75% 酒精消毒。所採水樣應具有代表性。
(三) 運送時水樣溫度應維持在小於 10℃ 且不得凍結,實驗室內保存溫度應維持在 4 ± 2℃。
(四) 水樣應於採樣後 24 小時內完成水樣過濾步驟(七、步驟(五)),並置入培養箱中培養。
(五) 水樣量以能做完所需檢驗為度,但不得少於 100 mL。
七、步驟
注意事項: Step 2 ~ Step 5須在無菌操作檯內操作。
八、結果處理
(一) 若原液及各稀釋水樣中,僅有一個稀釋度的二重複培養皿之菌落數均在 20 至 200 個之間,則選取該稀釋度之兩個培養皿,以下列公式計算總菌落數,單位為 CFU/mL (Colony forming units/mL):
總菌落數 (CFU/mL) = 選取培養皿之菌落數總和 / 選取培養皿之水樣體積實際總和 = (X+Y) / [(過濾體積/D)+(過濾體積/D) ]
註: D:選取培養皿之稀釋度
X、Y:D稀釋度的兩個培養皿之菌落數
(二) 若結果與八、(一)所述不符,則以下列方式計算總菌落數:
註:D1、D2:選取培養皿之稀釋度
X1、Y1:D1稀釋度的兩個培養皿之菌落數
X2、Y2:D2稀釋度的兩個培養皿之菌落數
(三) 數據表示:若計算所得之總菌落數小於 1(含0),以「<1 CFU/mL」表示;總菌落數小於100時,以整數表示(小數位數四捨五入);總菌落數為100以上時,只取兩位有效數字(四捨五入)。
(四) 檢測紀錄須註明採樣時間、培養起始及終了時間、培養基名稱、培養溫度及各稀釋度原始數據等相關資料。
註1:溶液如出現異物或混濁,則不可繼續使用。
註2:水樣如須稀釋,建議於稀釋後 30 分鐘內完成檢測步驟,以免造成細菌死亡或增生,影響實驗結果。
註3:培養箱底層應放置水盤,或將培養皿放置於密閉容器中培養,以避免培養前後培養基之水份散失超過 15%。
註4:本文引用之公告方法名稱及編碼,以環保署最新公告者為準。
水中微生物檢測 - 濾膜法
【微生物檢測】水中總菌落數檢測方法-濾膜法
一、方法概要
本方法係使用濾膜過濾水樣,於 35 ± 1℃ 以 m-HPC 培養基培養48 ± 3 小時後,計數水中好氧及兼性厭氧異營菌。
二、適用範圍
本方法適用於飲用水及地面水體、地下水體、廢水、污水、放流水之總菌落數檢測。
三、干擾
(一) 水樣中含有抑制或促進細菌生長的物質。
(二) 檢測使用的玻璃器皿及設備含有抑制或促進細菌生長物質。
(三) 濁度過高之水樣易造成濾膜孔隙阻塞,或造成細菌菌落瀰漫生長(Spreading)而影響水樣檢驗的觀察及結果的判讀。
四、設備
量筒 100 - 1000 mL |
吸管 10 mL 無菌玻璃/塑膠吸管,或無菌微量吸管(Micropipet) 刻度: 0.1 mL 刻度 |
稀釋瓶 100 -1000 mL硼矽玻璃瓶 耐高溫高壓滅菌 |
錐形瓶 200 - 1000 mL硼矽玻璃瓶 耐高溫高壓滅菌 |
培養皿 硼矽玻璃製品或市售無菌塑膠培養皿,大小為 60 × 15、50 × 12 mm 或其他適當大小 |
採樣容器 容量 120 mL 以上無菌之硼矽玻璃或塑膠有蓋容器,或市售無菌袋 |
能耐高溫高壓滅菌的玻璃、塑膠或不鏽鋼等過濾瓶組 |
冰箱 溫度能保持在 4 ± 2℃ |
水浴槽 溫度能保持在約 50℃ |
壓力差宜為 138 至 207 kPa |
濾膜 直徑 47 mm、孔徑 0.45 μm 且有格線的無菌濾膜 |
鑷子 前端平滑、內側無波紋,使用前浸泡於 95% 酒精再以火燄燃燒滅菌 |
培養箱 溫度能保持在 35 ± 1℃ |
高壓滅菌釜 溫度能保持在 121℃(壓力約 15 lb/in2 或 1.05 kg/cm2)滅菌 15 分鐘以上 |
高溫乾熱烘箱 如用於玻璃器皿等用具之滅菌,溫度須能保持在170 ± 10℃ 達 2 小時以上 |
天平 待測物重量大於2 g ,須能精秤至 0.01 g;待測物重量不大於 2 g 時,須能精秤至 0.001 g |
無菌操作檯 正壓式無菌操作檯或垂直循環負壓式無菌操作檯(Class II 生物安全櫃) |
精確度達 0.1 pH 單位。用於內含瓊脂培養基之 pH 值測定時,應搭配表面電極(Surface probe) |
五、試劑
(一) 試劑水:導電度在 25℃ 時小於 2 μmho/cm(μS/cm)。
(二) 培養基 m-HPC 瓊脂培養基(或稱 m-SPC 瓊脂培養基),依下列配方配製培養基,或使用市售商品化的培養基均可。
蛋白腖(Peptone) | 20.0 g |
明膠(Gelatin) | 25.0 g |
甘油(Glycerol) | 10.0 mL |
瓊脂(Agar) | 15.0 g |
試劑水 | 1 L |
(三) 無菌稀釋液
1. 磷酸二氫鉀儲備溶液 |
取 3.4 g 磷酸二氫鉀(KH2PO4)溶於 50 mL 之試劑水中,俟完全溶解後,以 1 N 之氫氧化鈉溶液調整其 pH 值為 7.2 ± 0.1。然後加試劑水至全量為 100 mL,滅菌(過濾滅菌或 121℃ 高溫高壓滅菌 15 分鐘以上)後,儲存於冰箱中備用。4 ± 2℃ 下保存期限為 6 個月(註 1)。可根據檢測需求量,依比例配製。 |
2. 氯化鎂儲備溶液 |
取 8.1 g 六水氯化鎂(MgCl2·6H2O)或 3.8 g 無水氯化鎂,先溶於少量試劑水中,俟完全溶解後,再加試劑水至全量為 100 mL,滅菌(過濾滅菌或 121℃ 高溫高壓滅菌 15 分鐘以上)後,儲存於冰箱中備用。4 ± 2℃ 下保存期限為 6 個月(註 1)。可根據檢測需求量,依比例配製。 |
3. 無菌稀釋液 |
分別取 10 mL 氯化鎂儲備溶液和 2.5 mL 磷酸二氫鉀儲備溶液,加入試劑水至全量為 2000 mL,混搖均勻後,分裝於稀釋瓶中,經 121℃ 高溫高壓滅菌15分鐘以上,作為無菌稀釋液備用。如欲用於水樣稀釋,分裝之無菌稀釋液滅菌後體積須為 90 ± 2.0 mL。4 ± 2℃ 下保存期限為 6 個月(註 1)。可根據檢測需求量,依比例配製。 |
六、採樣與保存
(一) 採微生物檢測之水樣時,應使用清潔並經滅菌之玻璃瓶、無菌塑膠容器或市售無菌採樣袋,且於採樣時應避免受到污染。水樣若含有餘氯時,應使用內含硫代硫酸鈉錠劑之無菌採樣袋,或於無菌容器中加入適量無菌之硫代硫酸鈉以中和餘氯(採取加氯之廢水時,每100 mL 之水樣如加入 0.1 mL 之 10% 硫代硫酸鈉,可中和之餘氯量約為 15 mg/L。採取含氯之飲用水水樣時,每 100 mL 之水樣如加入 0.1 mL 之 3% 硫代硫酸鈉,可中和之餘氯量約為 5 mg/L)。
(二) 飲用水採樣前應清潔手部,出水口以火烤或以 70% 至 75% 酒精消毒。所採水樣應具有代表性。
(三) 運送時水樣溫度應維持在小於 10℃ 且不得凍結,實驗室內保存溫度應維持在 4 ± 2℃。
(四) 水樣應於採樣後 24 小時內完成水樣過濾步驟(七、步驟(五)),並置入培養箱中培養。
(五) 水樣量以能做完所需檢驗為度,但不得少於 100 mL。
七、步驟
Step 1. | 水樣在進行檢測或稀釋之前必須劇烈搖晃 25 次以上,以使樣品充分混搖均勻。 |
Step 2. | 視水樣中微生物可能濃度範圍進行水樣稀釋步驟。使用無菌吸管吸取 10 mL 之水樣至 90 mL 之無菌稀釋液中,形成 10 倍稀釋度之水樣,混合均勻。而後自 10 倍稀釋度水樣,以相同操作方式進行一系列適當之 100、1000、10000 倍等稀釋水樣,並混搖均勻。進行稀釋步驟時,均需更換無菌吸管。水樣稀釋步驟如圖 1 所示(註 2)。 |
Step 3. | 以無菌鑷子夾起無菌濾膜,放在無菌過濾裝置之有孔平板上,小心將濾杯固定。加入適量無菌稀釋液,以測定過濾裝置是否配置妥當。 |
Step 4. | 以無菌吸管吸取 10 mL 的原液及(或)各稀釋度水樣至無菌過濾器中過濾。原液及(或)各稀釋度水樣皆需進行二重複。過濾後,再以 20 mL 以上之無菌稀釋液沖洗濾杯。 |
Step 5. | 沖洗過濾後,將濾杯移開,儘速以無菌鑷子取出過濾後之濾膜置於培養基上。濾膜應與培基完全貼合,以免產生氣泡。 |
Step 6. | 培養皿倒置於培養箱內,於 35 ± 1℃ 下培養 48 ± 3 小時(註 3)。 |
Step 7. | 若欲進行另一個水樣時,應更換無菌過濾器(濾杯)。亦可將過濾器(濾杯)以火烤後降至接近室溫重複使用。 |
Step 8. | 計數各稀釋度培養皿中所產生的菌落數並記錄之。若菌落太多造成計數困難時,則以「菌落太多無法計數」(Too numerous to count;TNTC)表示。但若各稀釋度培養皿之菌落數均超過 200 個,則不可記錄「菌落太多無法計數」,應選取最接近 200 個菌落數之同一稀釋度的兩個培養皿進行菌落計數,確實無法計數時應重新採樣檢測。 |
八、結果處理
(一) 若原液及各稀釋水樣中,僅有一個稀釋度的二重複培養皿之菌落數均在 20 至 200 個之間,則選取該稀釋度之兩個培養皿,以下列公式計算總菌落數,單位為 CFU/mL (Colony forming units/mL):
總菌落數 (CFU/mL) = 選取培養皿之菌落數總和 / 選取培養皿之水樣體積實際總和 = (X+Y) / [(過濾體積/D)+(過濾體積/D) ]
註: D:選取培養皿之稀釋度
X、Y:D稀釋度的兩個培養皿之菌落數
(二) 若結果與八、(一)所述不符,則以下列方式計算總菌落數:
- 若原液及各稀釋水樣中,僅有一個稀釋度的一個培養皿之菌落數在 20 至 200 個之間,則選取該稀釋度之兩個培養皿,以上述八、(一)公式計算。
- 若各培養皿之菌落數均小於 20 個,則選取菌落數最接近20個之同一稀釋度的兩個培養皿,以上述八、(一)公式計算。
- 若各培養皿之菌落數均不在 20 至 200 個之間,則選取菌落數最接近 200 個之同一稀釋度的兩個培養皿,以上述八、(一)公式計算。
- 若有兩個稀釋度的二重複培養皿之菌落數均在 20 至 200 個之間,或兩個稀釋度各有 1 個培養皿之菌落數在 20 至 200 個之間,則選取兩個稀釋度共 4 個培養皿,以下列公式計算:
註:D1、D2:選取培養皿之稀釋度
X1、Y1:D1稀釋度的兩個培養皿之菌落數
X2、Y2:D2稀釋度的兩個培養皿之菌落數
(三) 數據表示:若計算所得之總菌落數小於 1(含0),以「<1 CFU/mL」表示;總菌落數小於100時,以整數表示(小數位數四捨五入);總菌落數為100以上時,只取兩位有效數字(四捨五入)。
(四) 檢測紀錄須註明採樣時間、培養起始及終了時間、培養基名稱、培養溫度及各稀釋度原始數據等相關資料。
九、品質管制
(一) 微生物採樣人員及檢測人員應具備微生物基本訓練及知識。
(二) 每批次採樣時,應進行運送空白。
(三) 每 10 個樣品應執行 1 個方法空白樣品分析,若每批次樣品數少於 10 個,則每批次仍應執行 1 個方法空白樣品分析。
(四) 用於結果計算之二重複數據,其對數差異值不可超出精密度管制參考範圍(計算方式參考「環境微生物檢測通則—細菌(NIEA E101)」(註4)),除非二重複之菌落數均小於 20。
(五) 新購入之培養基,每批號均須進行培養基品質測試(測試方式詳見「環境微生物檢測通則—細菌(NIEA E101)」)。
(六) 本方法培養所得之細菌可能具有感染性,檢測後之培養基及器皿應經高溫高壓滅菌處理。
註1:溶液如出現異物或混濁,則不可繼續使用。
註2:水樣如須稀釋,建議於稀釋後 30 分鐘內完成檢測步驟,以免造成細菌死亡或增生,影響實驗結果。
註3:培養箱底層應放置水盤,或將培養皿放置於密閉容器中培養,以避免培養前後培養基之水份散失超過 15%。
註4:本文引用之公告方法名稱及編碼,以環保署最新公告者為準。